Planteanatomi

Mikroskopi

Tegninger

Takk

Mikroskopets historie

Mikroskopets historie går tilbake til de hollanske brødrene Zacharias og Francis Janssen som i 1590 laget briller. De oppdaget at det gikk an å kombinere to konvekse linser i et rør og få til en forstørrelse av objekter som de så gjennom linsen. Det var Faber av Bamberg, en lege som arbeidet for Pave Urban VII, som var den første som tok i bruk ordet mikroskop. Hollenderen Anton van Leeuwenhoek var den første som observerte levende celler. Mikroskopet han brukte bestod av en enkelt linse, altså ikke et sammensatt mikroskop. Det var laget av en tre tommer lang kvadratisk plate av kobber med en kuleformet linse og en juserbar spiss. Apparatet kunne holdes opp mot øyet og forstørret opptil 275 ganger. Leeuwenhoek kunne se bevegelige bakterier som han fant i munnen, 200 år før noen annen kunne se bakterier. Han observerte spermatozoer i sæd og var den første som så protozoer, amøber i vann, og blodceller i fiskeblod. Robert Hooke (1635-1703) var den første som observerte planteceller i tynne skiver av barken av korkeik, observert gjennom et egenprodusert mikroskopet og beskrevet i Micrographia.

Amici konstruerte et refleksjonsmikroskop i 1823 og observerte pollenslangen fra pollen. Louis Joblot, fransk mikroskopiker, brukte direkte, ikke reflektert lys, og holdt mikroskopet mot øyet som et teleskop. De første mikroskopene hadde ujevnt glass med kromatisk aberrasjon, synsfeltet var lite, mangel på lys var et problem.

Gamle mikroskoper fra planteanatomiundervisningen Bot lab UiO

Louis de Broglie oppdaget i 1924 at elektroner oppfører seg på samme måte som lys ved å være bølger og partikler. Dette ga grunnlaget for elektronmikroskopene. E. Ruska konstruerer et "supermikroskop" i 1933 som forstørret 12.000x. På 1970-tallet kom scanning-elektronmikroskopene og seinere konfokale mikroskop.

Rødt og blått lys brytes forskjellig

I 1678 presenterte Christiaan Huygen sin bølgeteori for lyset. Bølgelengden for lyset måles i nanometer (nm).

Hvis lys treffer en buet glassoverflate blir det ikke bare forsinket, men også avbøyd. Avbøyningen kalles brytning og avhenger av innfallsvinkel til lyset, og krumning og tetthet av glasset. Linjen vinkelrett på overflaten til linsen kalles innfallsloddet. Beveger lyset seg fra luft til linse så bøyes lyset mot innfallsloddet. Fra glass til luft går lys fra innfallsloddet. Derfor ser en kvist ut til å brekke ved overflaten når den er dyppet ned i vann. Et annet eksempel er hvorfor gjenstander under vann ser ut til å være nærmere overflaten enn de egentlig er. Det er vanskelig å få alle lystrålene fra et punkt i fokus pga. linsefeil. Kromatisk aberrasjon (forvrengning) skyldes at de forskjellige bølgelengdene av lys brytes forskjellig. Lys med kortere bølgelengde f.eks. blått lys brytes mer enn lys med lengre bølgelengde f. eks. rødt. Dette kan korrigeres ved å bruke flere typer glass som er satt sammen slik at brytningsindeksen blir uavhengig av bølgelengden. Sfærisk aberrasjon (forvrengning) kalles fenomenet hvor lysstrålene i ytterkantene av linsen ikke er i fokus samtidig med dem som går gjennom den sentrale del av linsen. Det skyldes at linsens styrke er størst i ytterkant og kanten av linsen bringer strålene i fokus nærmere linsen enn stråler som treffer sentrum av linsen.

Lys og elektron - bølge og partikkel

Både lys og elektroner kan oppføre seg partikler og bølger. Når lys og elektroner passerer gjennom linser og samles i fokus gir de et bilde som skyldes interferens av bølgene, et fenomen kalt diffraksjon. En linse har en karakteristisk brennpunkt (fokaltpunkt) og brennvidde (fokallengde). Fokallengden er avstanden mellom midtlinjen i linsen og punktet der strålene som passerer gjennom linsen konvergerer.

Vinkelaperturen er den halve vinkelen av den lyskjeglen som kommer inn i objektivlinsen til mikroskopet fra preparatet. En lavaperturlinse har liten , en høyaperturlinse har høy . Jo større aperturvinkelen er dessto mer informasjon kan linsen formidle. aaa

Den viktigste egenskapen til en linse er oppløsningen. For å illustrere dette kan vi se hvordan bilde blir av et uendelig lite punkt igjennom linsen. Bilde blir ikke et punkt der hvor strålene kommer i fokus, men de danner et interferensmønster. Det resulterende bilde blir et punkt hvis størrelse og form er et resultat av diffraksjon av lys som kommer igjennom linsen. Oppløsningen avhenger av diffraksjonsforskjellen og påvirkes av tre faktorer: bølgelengden til lyset, vinkelaperturen og brytningsindeksen til mediet omkring prøven. Brytningsindeksen er et mål på forandring i hastigheten til lyset da det passerer fra et medium til et annet. Lys beveger seg i rette linjer og lys brytes (refraksjon) i overgangen mellom to gjennomsiktige medier. Huygen fremsatte sin teori om at lyset fra en punktformet lyskilde brer seg ut i rommet i form av elementærbølger i en bølgefront. Ifølge Huygens bølgeteori kan lyset spres (scattering) eller avbøyes (diffraksjon) og det kan gi opphav til interferens (to lysbølger som reagerer med hverandre). Diffraksjon kan forklares ut fra bølgenaturen til lyset. Hvert punkt i en lysbølge er utgangspunkt for nye bølger som brer seg jevnt i alle retninger.

En bølge kan representeres med ligningen

med amplityde a og bølgelengde (lambda) som beveger seg i retning x. Bølgebevegelsen kan også angis som en tilsvarende vektormodell med en roterende vektor festet i origo i en sirkel. Størrelsen av vektoren viser amplityden til bølgen og vinkelen (theta) i forhold til xy-koordinatsystemet viser fasen av bølgen. lq

Bølgelengden er tiden det tar for lysbølgen å bevege seg en bølgelengde bortover X-aksen. Det er også tiden det tar å rotere vektoren 2 (pi) radianer. Vi får da sammenhengen: p

er fasen til lyset. q

En faseforskjell på radianer vil tilsvare en veiforskjell på p

Lys som har sin opprinnelse fra samme punkt i en lyskilde kalles for koherent. Intensiteten til lyset er avhengig av amplityden. Koherente lysbølger i samme fase som interferer med hverandre vil gi en resultantbølge med større amplityde. Er bølgene ute av fase med hverandre vil amplityden bli mindre og lyset svakere.

Interferens

Bølger som er radianer ute av fase med hverandre gir ikke noe lys. To bølger med samme amplityde og fase vil gi lik fase, men dobbelt amplityde. Et eksempel på interferens er multippel refleks i tynne filmer og som kan observeres i såpebobler, olje på vann eller i et interferensfilter. 

Diffraksjon gjennom en linse

Lysstrålene som kommer inn i objektivet i mikroskopet kommer fra objektglass og dekkglass. Kondensor lager en lyskjegle som passerer gjennom objektglasset og strålene i den sentrale delen av kjeglen brytes forskjellig fra strålen i sentrum. Etter å ha passert gjennom objektet må det avbøyde lyset (diffraksjon) passere igjennom et medium med brytningsindeks . Ifølge Abbés kriterium for oppløsning må objektivlinsen være vid nok til å samle opp minst nullte og begge første ordens diffraksjonsmønster. Dvs. jo mer av diffraksjonsmønsteret som tapes desto dårligere bilde. m til objektivlinsen med vinkelapertur a

Når lys som kommer fra et punkt i objektplanet og konvergeres ved hjelp av en linse vil det i bildeplanet gi en sirkel med en serie konsentriske ringer (lysflekk, airy disc). Diffraksjonsflekkens størrelse avhenger av diameteren til linsen og lysets bølgelengde. Intensitetsprofilen av flekken er vist på figur og avstanden mellom de to minimumspunktene i toppen er gitt ved

er bølgelengden av lyset, n er brytningsindeksen i mediet mellom objekt og linse og er halve aperturvinkelen. la

To objekter nær hverandre vil gi to flekker. Ligger det meget nær hverandre kommer intensitetsmønsterne til å delvis overlappe hverandre. Ifølge Rayleighs kriterium vil to lysflekker (Airy discs) atskilles hvis maksimum diffraksjon fra den ene flekken faller sammen med første minimum av den andre.

Jo bredere konus av lys fra prøven som treffer fronten av objektivlinsjen, desto finere detaljer kan observeres. Den største teoretiske vinkelen for a = 90^o. Det maksimale som kan oppnås i praksis er 85^o.

Oppløsningsevnen r kan kvantitativt beskrives som

hvor er bølgelengden til lyset, n er brytningsindeksen til mediet mellom prøven og objektivlinsen og ×sin kalles den numeriske apertur (NA). Oppløsningsevnen avhenger av bølgelengden til lyset () , og objektivets numeriske apertur. Den numeriske apertur er et mål på størrelsen av lyskjeglen som objektivet kan motta og uttrykkes i sinus til vinkelen. la er aperturvinkelen. nal

Oppløsningsevnen r er et mål på hvor nær to punkter kan være hverandre og fremdeles atskilles. For å få størst mulig oppløsning må telleren være så liten som mulig og nevneren størst mulig. Vanlig synlig lys med kortest mulig bølgelengde blir blått lys med bølgelengde 450 nm. Hvis vinkelaperturen er 70^o dvs. sin =0.94 blir grensen for oppløsning i et blåttlysmikroskop 292 nm med brytningindeks for luft ca. 1. 

Ved å bruke immersjonsolje med brytningsindeks ca. 1.5 blir den maksimale numeriske apertur 1.5x0.94 dvs. 1.4 og minste oppløsning blir 196 nm. Maksimalt i et lysmikroskop ca. 1000 x den numeriske apertur dvs. ca. 1000 x forstørrelse i luft og 1400 x forstørrelse med immersjonsolje. Bølgelengden for elektroner er derimot fra 0.1-0.2 nm. Elektronmikroskopet kan forstørre ca. 100 x mer enn lysmikroskopet dvs. ca. 100.000 x. Oppløsningen kan økes ved å minske bølgelengden eller å øke n og økes ved å minske avstanden fra objekt til linse eller å øke linsestørrelsen. Numerisk apertur (NA) kan bli opptil 1.4 . Oppløsningen ved å bruke 500 nm lys blir derved: (0.61 500 10^-9)/1.4 dvs 200 nm a. a××

Den numeriske aperturen øker når forstørrelsen øker, som igjen vil bety økt oppløsning. Det er alltid mulig å øke forstørrelsen ved å tilføre flere linser, men dette er uten verdi hvis ikke NA øker. Ved høyeste forstørrelse legges olje på objektglasset. Mange oel. objektiver (oljeimmersjonsobjektiver) har stor kromatisk aberrasjon slik at forstørrelsen av blått blir 2 x av rødt.

Lysmikroskop

Et sammensatt mikroskop består av to linsesystemer. Et forstørret bilde av av første linsesystem forstørres ytterligere av det andre . Først skjer det en forstørring via objektivlinsen. Bildet faller i et plan slik at det kan sees av det andre linsesystemet, okularet. Det primære bilde blir forstørret av okularlinsen, eller øyestykket.

Preparatet belyses av et eget linsesystem, kondensor. Lyset blir til en kjegle i preparatplanet og hele preparatet må belyses. Hvis man ser på to lysstråler fra kanten av det belyste feltet vil en av dem gå igjennom mikroskopet parallelt med optisk akse inntil det når objektivlinsen og brytes mot den optiske akse. Den andre passerer gjennom linsens optiske midtpunkt og brytes ikke. Begge fokuseres lenger opp i tubus og blir til et virkelig omvendt bilde som betraktes av okularet. Hvis vi plasserer en linse litt over dette bilde vil strålene ha skåret hverandre innen de når linsen. Denne situasjonen svarer til den første: en stråle gjennom linsens midtpunkt og den andre passerer i periferien og brytes. Strålene divergerer. Hvis vi nå følger dem bakover vil de fokuseres slik at de lager et opprett innbilt bilde av primærbilde og det er dette som betraktes av øyet.

Kombinertmikroskopet er sammensatt og kombinerer flere linser. Lysstrålene fra lyskilden passerer kondensorlinsen som sender lyset mot prøven som er montert på en glassplate på objektivbordet. Objektivlinsen er plassert like over prøven og gir det primære bilde. De fleste mikroskoper har flere objektivlinser med forskjellig forstørrelse og disse sitter på en roterbar skive (objektivrevolver) og kan bringes inn i lysveien ved å dreie på skiven.

I noen mikroskoper er det intermediære linser mellom objektiv og okularlinsen som gir ytterligere forstørrelse. Forstørrelsen i tubus kan være gravert inn f.eks. 1.25. Vanlig tubuslengde er 160 mm.

Forstørrelsen bestemmes av objektiv og okularlinsen. Vi kan beregne den totale forstørrelsen av preparatet ved å multiplisere forstørringskapasiteten til objektivlinsen og okularlinsen og den intermediære linsen. En 10 x objektivlinse, 2.5 x intermedinær linse og 10 x okular gir 250 x forstørrelse.

Et lysmikroskop består av fra øverst et okular, tubus, objektivlinser plassert på en objektivrevolver, og et objektivbord. På et gonimeterbord roteres preparatet og på et kryssbord kan objektet flyttes frem og tilbake ved reguleringsskruer. Mikroskopipreparatet ligger vanligvis på et objektglass dekket av et dekkglass med tykkelse 0.17 mm. Under objektivbordet sitter kondensor og en lyskilde med kollektor. Objektet bringes i fokus vha en grovskrue og finskrue. Mikroskopene kan se noe forskjellig ut, men oppbygningen er i prinsipp den samme. Lyset fordeles i to okularer vha et prisme. Objektivene er av typen 10 x, 25 x, 40 x og 100 x. Okularene av type 10 x og 12.5 x. Brytningsindeksen mellom immersjonsolje og luft er ca. 1.515. Et 10 x objektiv gir et ca. synsfelt på 1.25 mm, et 40 x objektiv gir 0.31 mm, 2.5 x gir 4.5 mm. Fargekorriggerte objektiver kalles apokromater (akromater rød/blå). Apokromater gir størst korreksjon for grønt lys. De andre fargene behandles i par. En ulempe er at små objekter får grønnfarge. Glasset tilsettes fluoritt for å unngå dette. Apokromatene ble laget første gang av Ernst Abbé som arbeidet hos Carl Zeiss.

Kondensor er et flerlinset system som skal konsentrere lyset i preparatplanet. Kondensor består av en plankonveks topplinse og en større bikonveks linse. Siden topplinsen bare belyser et lite område av preparatet må denne vippes tilside ved bruk av objektiver med liten forstørrelse for å få belyst hele synsfeltet. Kondensor er plassert under objektbordet og kan heves eller senkes ved reguleringsskruer, fin- og grovskrue.

Kondensor må ha NA stor nok til å gi objektivet en nødvendig lyskjegle. Kondensor må også kunne belyse store felt ved lav forstørring. Det blir to motstridende prinsipper. Større NA gir mindre belyst flate. Derfor har kondensor en øvre linse som kan svinges ut av lysveien ved dreining og kondensorens styrke reduseres. Man skal ikke senke kondensor for å få utfylt lysfeltet.

Under kondensor ligger en regulerbar aperturblender. Ved kanten av en spalte er det ikke noen skarp overgang fra lys til mørke, men en oscillerende lysintensitet som skyldes brytning (diffraksjon). Når lys faller inn i en linse brytes lyset slik at det treffer linsens brennpunkt. Kommer lyset på skrå inn i lisen vil det brytes mot et punkt i linsens brennplan. Motsatt hvis et lysende punkt plasseres i brennplanet eller brennpunktet vil det gi en bunt med parallelle lysstråler på den andre siden av linsen. Dette benytter vi når vi skal belyse preparatet. Istedet for å ha selve lyskilden like under konsenor lages det en optisk avbildning av lyskilden under kondensor. Avbildningen lages ved en linse kalt kollektor (lyset plasseres i kollektors brennpunkt) som finnes i lampehuset, og det lages en skarp avbildning av glødetråden i planet til aperturblender. Like foran kollektor ligger det en irisblender, også kalt feltblender. Kollektorlinsen fokuserer et bilde av lyskilden på kondensoririsblender. Størrelsen på irisblender innstilles slik at bildet av den ikke er større enn synsfeltet. Aperturblender regulerer bildets kontrast og mikroskopets evne til å avbilde fine detaljer, og skal ikke brukes til å regulere lysstyrken på preparatet. Stor aperturblender (f2) gir lav kontrast og god oppløsningsevne. Liten aperturblender (f.64) gir høy kontrast og dårlig oppløsning. Vi må derfor finne et kompromis mellom kontrast og oppløsningsevne hvor vi får maksimal detaljrikdom og skarphet.

Hvis kondensor er riktig plassert og man tar ut okularet og ser ned i tubus vil en kunne se aperturblender avbildet. Ofte innstilles aperturblender på 3/4 apertur vil det si at aperturdiameter er 3/4 av objektivlinsens.

Kondensor og objektivets numeriske apertur bør være like. Belysningsapertur større enn 1 kan bare oppnås ved oljeimmersjon. Kondensor bør ha liten kromatisk og sfærisk aberrasjon. Kondensor bør ha sentrerbar fatning og irisblender.

Kondensorlinsen er laget for å samle og belyse prøven jevnt. Kondensorlinsen fokuserer et bilde av feltblender i planet til prøven. Lyset må forlate objektplanet med en vinkel som minst er lik a for å utnytte oppløsningsevnen til objektivet. "Lyset må fylle den numeriske aperturen". Lyset må dessuten være jevnt over objektet. Det er flest feil ved innstilling av kondensor. Optimalisering utføres ved Köhler belysning eller kritisk belysning hvor objektet belyses ved en konisk lyskjegle.

Okularer kan være av typen Ramsdel eller Huygens og er basert på to linser i hver sin ende av et rør eller en kompensator som er to linser sammen. Man kan skille okularene fra hverandre ved å holde dem mot lyset og se på fargespillet i okularblender. Blå rand gir Huygenokular og gul-oransje er kompensasjonsokular. Okularet virker som et forstørrelsesglass og "bringer" objektet nærmere øyet. Huygens okular brukes til rutineobjektiver av type akromater. Kompensasjonsokular brukes sammen med mer kostbare objektiver av type apokromater.

Okularet har to linser. Den nederste (feltlinse) samler bilde fra objektivet, reduserer det og gjendanner det inne i okularet ved nivå synsfeltblender. Denne kan sees ved å fjerne okularets øverste linse. Enhver gjenstand ved synsfeltblender vil være i fokus ved synsfeltet. Den øverste okularlinsen (øyelinsen) danner et forstørret innbilt bilde som betraktes. Skjæringspunktet for strålene som utgår fra øverste okularlinse blir en smal lysskive som betegnes utgangspupillen. Personer med briller anvender okular med høytliggende utgangspupill.Brilleokular er merket med en brille. Måleokular er en målestokk i okularet som skal passe sammen med objektbordet hvis enhetene kjennes.

Köhler-innstilling av mikroskopet

Bruk f.eks. pollen som preparat.

1. Fjern okular og se i tubus
2. Flytt lyskilden inntil lyset er i senter av objektivlinsen.
3. Hvis kondensor også er flyttbar fjern denne og lyset sentreres.
4. Kondensor flyttes på plass og fokuseres etter Köhlers eller kritisk belysning.
5. Lysintensiteten skal aldri reduseres ved å forandre aperturen. Bruk filter istedet.

Objektivlinsen, okularet og øyet (eventuelt kamera) fokuserer sammen bildet på netthinnen (filmplanet). Dette gir to sett med optiske lysveier og bildeplan.

Først sentreres kondensor slik at bilde av feltblender viser seg i midten av synsfeltet og ligger ovenpå den fokuserte prøven. Lyskilden fokuseres slik at dens bilde dannes i kondensoririsblender. Etter at lyskilde, kollektor, kondensor og objektivlinse står på rett linje må felt og kondesoririsblender justeres. Sett kondensor i øverste stilling. Bruk 10 x objektiv. Når mikroskoppreparatet er i fokus innstilles kondensorhøyden.

Blend irisblender ned. Det skal da være mulig å se denne blender i synsfeltet. Reguler kondensorhøyden til irisblender er i sentrum. Åpne blenderen til hele synsfeltet er belyst. Hvis det ikke går legg et mattfilter i filterholderen til kondensor. Irisblender er nå korrekt og kondensorblender må nå innstilles. Kondensorblender er i fokus i objektivets bakerste brennplan. For å undersøke dette fjernes okularet og man kikker ned i tubus. Når kondensorblender er helt åpen skulle objektivets bakerste linse være fylt av lys. Man får best resultat når 2/3 av denne lyskjeglen benyttes. Nedblend kondensorblender til denne tilstand nås. Hvis kondensorblender er for åpen blir det ubehagelig overbelysning og hvis under 2/3 får man mindre oppløsning. Dette belysningssystemet kalles kritisk belysning.

Feltblendens funksjon er å regulere flimring som kommer fra refleksjoner fra overflater av linser. Det belyste området av prøven bør være så lite som mulig, men slik at hele området rundt prøven er belyst. Bildet av feltblender skal sees i kanten av synsfeltet. Innstillingen av kondensoririsblender er viktigere enn feltblender. Den bestemmer den vinkelen av lyskjeglen som belyser prøven. Før lyset kommer til kondensorlinsen passerer det kondensoririsblender hvor lysstrålene er nær parallelle. Jo mindre blende dessto smalere lyskjegle kommer ut av kondensor. Diameteren på midten av kjeglen forandres ikke når blender åpnes og lukkes.

Fasekontrastmikroskopi

Prinsippet for fasekontrastmikroskopet ble oppdaget av Zernicke. Vårt øye er følsomt for forskjeller i bølgelengder (farge) og i amplityde (lysstyrke), men ikke for fase (en forsinkes i forhold til en annen). Lys som går gjennom objektet vil endre fase. Øyet kan ikke oppfatte disse faseforskjellene, men de kan ved forskjellig måte omdannes til amplitydeforskjeller og da kan vi se dem. I fasekontrastmikroskopet gjøres dette ved filteranordninger. Det settes inn en faseplate i lysveien over objektivlinsen. Denne svekker lys som ikke er blitt avbøyd i preparatet og forsinker det med en kvart bølgelengde. Når dette lyset har passert filteret vil det være i fase eller motfase med de brutte strålene og ved interferens vil det enten øke eller minske de brutte strålenes amplityde dvs. konstrasten forsterkes.

Vi får et amplitydeobjekt og ser objektet pga. forskjell i lysstyrke. Bølgelengden er den samme.

I et faseobjekt forandres lyslengden i objektet. Lyset kan derved komme ut i motsatt fase enn hva som gikk inn. Hvorvidt lysstrålene kommer i fase eller ikke avhenger av glassets dimensjoner.

Lys som brytes i forskjellig grad blir forsinket og som følge av negativ interferens virker mørkere. Kontrast oppstår fordi lys kan interferere. Hvis en lysstråle forsinkes med en halv bølgelengde forsvinner lyset. En lysstråle er satt sammen av mange individuelle lysstråler. Når lysstrålene passerer preparatet blir hastigheten deres påvirket av de fysiske egenskapene til preparatet. Strålene diffrakteres og fasen forandres når de passerer gjennom forskjellige områder og de strålene som går igjennom prøven er ute av fase i forhold til de som går utenom. Vi kan utnytte dette ved å sette inn i lysveien et materiale som bringer det direkte ubrutte lyset i fase med det som har blitt diffraktert. Kontrasten skyldes interferens mellom en ubrutt stråle og lys som brytes av objektet. Lyset brytes forskjellig i forskjellige vev. Ved brytningen forsinkes lysbølgene mer eller mindre slik at de ikke kan holde følge med hverandre. I fasekontrastmikroskopi holdes bølger tilbake som brytes av preparatet 1/4 bølgelengde ved å øke denne til 1/2 bølgelengde. Fasekontrast brukes til å øke kontrasten til ufargede celler.

Det benyttes en spesialkondensor. I kondensor ligger en skive med ringformede blendere som kan svinges inn i strålegangen en ad gangen, en for hvert objektiv. Man må passe på å sette kondensorskiven til samme tall som objektivet. Faseobjektivene er merket Ph10x, Ph40x, Ph100 x oel. Blender består av en glassskive pådampet metall med et ringformet område uten metall. Tilsvarende finnes en faseplate i objektivet. Faseringen i objektivet skal dekke området uten metall i kondensorblenden. Objektet belyses med en hul konisk stråle. Hvis det ikke er noe objekt faller en lysring på objektivet. Bak objektivet er det en faseplate med ring med 1/4 bølgelengde lenger eller rand med 1/4 bølgelengde kortere. For å få samme intensitet på brutt lys (av objektivet) og ubrutt lys legges en tynn film av sølv på faseplaten. Ubrutt og brutt lys samles av objektivet har forskjell i fase med 1/2 bølgelengde og ødelegges da av inteferens og gir mørk bakgrunn. Når et objekt er tilstede har lyset to komponenter: 1) gjennom objekt og medium og 2) lys brutt av objektet. Objektet selv gir faseforskjell som blir lagt til faseforskjellen skapt av faseplaten og gir tap av ødeleggende inteferens dvs. objektet blir mer lysende enn bakgrunnen.

Kondensorringen er konstruert slik at den belyser preparatet med en hul lyskjegle. Objektivlinsen danner et bilde av denne lyskilden (av ringen) i sitt bakerste plan hvor faseplaten er. Faseplaten er en glassplate med en utfrest sprekk. I sprekken er det et materiale som absorberer lys, men ikke forsinker det. Spalten svarer helt til bilde av kondensorringen. Resten av platen er behandlet med et stoff som forsinker lyset med en kvart bølgelengde.

Lys som går gjennom preparatet og sprekken tilbakeholdes en kvart bølgelengde mindre enn det brutte lyset som går igjennom resten av platen. Det lyset som brytes av preparatet er nå forsinket en halv bølgelengde i forhold til lys som går gjennom kondensor. Interferens mellom de typene av lysstråler gir en fasekontrastvirkning.

En hjelpekikkert kan brukes til fokusering.

Interferens og fasekontrastmikroskopi har stor verdi fordi objekter kan sees uten å farges. Det er liten forskjell i absorbsjonen mellom mediet og det som sees derfor blir det liten forskjell i amplityde mellom lys som går gjennom og utenom objektet, men det vil bli faseforskjeller fordi brytningsindeksen er forskjellig.

Fasekontrast - Innstilling av mikroskopet

Først Köhlerinnstilling uten ring i kondensor. Fokuser preparatet og skyv ringen som passer til faseobjektivet på plass i kondensor. Fjern okularet og sett inn et hjelpemikroskop med fasekonstraststoff.

Når hjelpemikroskopet er fokusert ser man objektivets bakerste brennplan med den mørke faseringen sentralt plassert (fast). Over denne sees det lyse bilde av kondensorringen. Juster bildets sentrering med ringsentreringsskruen og fokuser bildet til det nøyaktiv dekker den mørke faseringen. Ringen har egne justerinsskruer. Plasseringen av faseringen kontrolleres hver gang. En lys ring rundt objektet ved fasekontrast oppstår fordi noe av det ubrutte lys uunngåelig passerer gjennom faseplaten.

Polarisasjonsmikroskop

Lys er elektromagnetisk stråling bestående av en elektrisk og en magnetisk vektor som vibrerer i rett vinkel på hverandre. Definisjonsmessig sies polarisasjonen å skyldes den elektriske vektoren. Turmalin er eksempel på en krystall som får lyset til å vibrere i en retning etter å ha passert den. Polarisasjonsfiltere er krystaller utstrakt på en plastfilm. Lys hvor den elektriske vektoren vibrerer parallelt til den lange aksen av krystallen sies å være planpolarisert via en polarisator. Lyset kan stoppes av en analysator når den plasseres i rett vinkel på polarisator. Polarisator plasseres mellom lyskilde og kondensor og analysator over objektivet. Noen krystaller forsinker bevegelsen av lys som er polarisert i ett plan forskjellig fra lys polarisert i et annet plan. Dette fenomenet kalles dobbeltbrytning (birefrigence, anisotropi) og er karakteristisk for gjennomsiktige krystaller. Svingeplanet dreies av krystallen. Stivelseskorn er et dobbeltbrytende objekt som i polarisasjonsmikroskop ses som et malteserkors. Cellulose i celleveggen er et annet eksempel på et dobbeltbrytende objekt. I en fiber vil man forvente at brytningsindeksen for lys som vibrerer parallelt til fiberlengden vil bli større enn for lys som vibrerer i rett vinkel. Ethvert mikroskop kan lages om til polarisjonsoptikk ved å stikke en polarisator mellom lyskilden og kryssbordet og en analysator mellom kryssbord og øyestykke.

Vi kan minske hastigheten til lys ved brytning, og minske amplityden ved absorpsjon.

Alle objekter med partikler i parallell eller stablete disker vil passere planpolarisert lys bare i en retning hvis polarisasjonsplanet er parallelt med partiklene. Objektet belyses med parallelt lys. Hvis polarisasjonsfilter og analysator stilles 90 o på hverandre sees intet lys. Hvis et objekt ligger i annen vinkel enn 90o for polarisasjonsplanet vil det polariserte lyset få to komponenter.

For å skille horisontalt (=) fra vertikalt (II) brukes en dreibar kompensator bestående av en glimmerplate mellom polarisator og analysator. Første ordens lys vil gi en rød farge, mens f.eks. et stivelseskorn får to deler med blå farge og to deler med gul farge hvis man bruker en kompensator.

Differensiell interferenskontrast mikroskopi (DIK)

Interferensmikroskopet er en videreutvikling av fasekonstrastmikroskopet hvor man har to forskjellige lysstråler. En stråle går gjennom preparatet og en referansestråle gjør det ikke. Det er egentlig to like mikroskoper satt sammen til ett. Forskjell i veilengde måles nøyaktig slik at det kan brukes til å bestemme fluoresens.

På samme vis som fasekontrastmikroskopi avhenger DIK av faseforandringer av lyset når det passerer igjennom prøven. Man ser på gradienter i brytningsindeks i prøven. Siden de største faseforskjellene vanligvis skjer i kanten av celler hvor brytningsindeksen er relativt konstant innen cellen, vil ytterkantene av cellene gi et ekstra sterkt signal. De optiske komponente i DIK er en polarisator, analysator og et par med Wollastonprismer (e briten W.H. Wollaston (1766-1828).. Polarisator og Wollastonprisme splitter en lysstråle og skaper to lysstråler som er atskilt med en liten avstand i lysretningen. Etter å ha passert prøven settes lysstrålene sammen igjen ved å passere det neste Wollastonprisme. Siden de to lysstrålene interferer med hverandre vil den resulterende polarisasjonen roteres litt i forhold til utgangspunktet. Denne rotasjonen undersøkes med analysator. Brukes til å studere levende ufargede preparater.

Fluorescensmikroskopi

Fluorescensmikroskopi baserer seg på UV lys som treffer et fluorescerende stoff (fluorokrom) som sender ut fluorescerende lys. Et fluorokrom kan også være festet til et indikatormolekyl f.eks. et antistoff. Fluorescens starter med absorbsjon av lys og ender med lysutsendelse fra det fluorescerende stoffet. F.eks. sender klorofyll ut rødt fluorescenslys. Når et atom eller molekyl mottar et foton med rett energi vil et av elektronene gå fra grunntilstanden til et høyere eksitert nivå, første eller andre singlett. Det sendes ut fluorescens når elektronet faller tilbake til grunntilstanden. Fluorscensmikroskopet har et eksitasjonsfilter mellom lyskilden og kondensorlinsen og som gjør at bare ultrafiolett lys kommer igjennom prøven. Etter objektivlinsen passerer lyset et barrierefilter som bare slipper igjennom det synlige fluorescenslyset med ønsket bølgelengde. Fluorscensmikroskopi kan være basert enten på 1)gjennomfallende lys eller 2) påfallende lys hvor UV-lys sendes gjennom objektivet. Det fluorescerende stoffet Calcofluor ® binder seg til cellulose og kan brukes til å studere celleveggene i planter i fluorscensmikroskop.

Videomikroskopi erstatter bildeplanet som lages av okularlinsen med et videokamera

Mørkefeltsmikroskopi

Preparatet belyses med en spesiell kondensor som sender ut skjevt lys. Lyset vil bare passerer gjennom tubus hvis det reflekteres og spres av preparatet dvs. bare fra objekter som har brytningsindeks som er forskjellig fra omgivelsene. Fokuserer en hul lyskjegle på preparatplanet. Objektivet plasseres i midten av den hule kjegle slik at ikke noe lys når objektet direkte.

Konfokal mikroskopi

Bruker en laser som lyskilde, et scannende speil og et lite hull i bildeplanet gjør at lys over og under fokusplanet, som ellers ville gitt et uskaprt bilde, blir forkastet. Bare et lite punkt er synlig ad gangen og disse punktene adderes til et bilde. Derved øker oppløsningen langs den optiske aksen dvs. gir økt oppløsning i dybden.

Elektronmikroskopi

I 1879 fant J.J. Thomson ved Cambridge at stråler fra katode i vakuum sender ut elektroner. L. de Broglie oppdaget i 1924 at elektronet også beveget seg som bølger. I 1926 kunne man fokusere elektronstrålen med et magnetfelt (elektronlinse). Bildene fanges opp av en fluorescerende skjerm. Astigmatisme skyldes at linsens styrke i ett plan er forskjellig fra det andre planet.

Takk

Takk til min lærer i plantefysiologi og planteanatomi førstelektor Julie Kjennerud som ga meg den første innføring i planteanatomi, og til preparant Eva Bovim som har laget mikroskopipreparatene vi bruker i planteanatomiundervisningen og som viste meg hvordan hun laget dem. Takk til professor Rolf Berg - min inspirerende lærer i høyere planters morfologi og systematikk.

Litteratur

 

Bowes, Bryan G.: A colour atlas of plant structure (1997). Manson Publishing.

Braune, W., Leman, A. & Taubert, H.: Pflanzenanatomisches Praktikum vol I (1987) og vol II (1990). Gustav Fischer Verlag.

Cutter, E.G.: Plant anatomy. I Cells and tissues (1978). II Organs (1971). Edward Arnold.

Esau, K.: Plant anatomy. John Wiley & Sons 1965.

Fahn, A.: Plant anatomy. Pergamon Press 1990 (4. ed).

Duncan, G.: Physics for biologists. Blackwell Scientific Publications 1975.

Hawes, C.R., Coleman, J.O.D. & Evans, D.E. (eds) Soc. Exp. Biol.sem ser 45. Endocytosis, exocytosis and vesicle traffic in plants. Cambridge Univ. Press 1991.

Mauseth, J.D.: Plant anatomy. The Benjamin/Cummings Publ. Comp. 1988.

Margulis, L.: Symbiosis in cell evolution. Freeman and Comp. 1993.

Juniper, B.E. & Jeffree, C.E. : Plant surfaces. Edward Arnold 1983.

Perry, J.W. & Norton, D.: Photo atlas for botany. Wadsworth Publ. Comp. 1998.

Taiz, L. & Zeiger, E.: Plant physiology. Sinauer Assoc Publ. Inc. 1998.

Tllbake til hovedside