Når lys absorberes i fotosystem I i fotosyntesen skjer det analogt som i fotosystem II en ladningsseparasjon i reaksjonsenterklorofyllet (P700) som først blir eksitert av lys til eksitert reaksjonssenterklorofyll (P700*), og deretter blir oksidert til P700+ når elektronet overføres til en primær elektronakseptor etklorofyll eller fyllokinon. Elektronet overføres herfra til Rieske jern-svovelproteiner (jern bundet til svovel i stedet for hem som i cytokromer). Elektronene overføres videre til ferredoksin (et jern-svovelprotein) som er løselig i stroma i kloroplastene, og til slutt til NADP+ katalysert av enzymet ferredoksin-NADP+-oksidoreduktase som blir til reduksjonskraften NADPH. Elektronhullet som blir igjen i P700+ fylles raskt opp med elektroner fra plastocyanin. Klorofyllproteinene ligger så tett at energien fra lyseksiterte elektroner blir fraktet fra et klorofyllmolekyl til det neste via resonans.
Fotosystem I er vesentlig plassert i stromathylakoidene og de ytre delene av grana sammen med ATP syntase. Den forskjellige lokaliseringen av fotosystem II og I gjør at planter kan tilpasse seg endringer i tilgangen på lys. Den fysiske atskillelsen at fotosystem II og I kobles sammen med plastokinon, plastocyanin og ferredoksin som kan forflytte seg i membranen. De korte avstandene det her er snakk om gjør at diffusjonen kan skje meget raskt.