Polynukleotid fosforylase katalyserer den reversible reaksjonen:
(NMP)n + NDP ⇔ (NMP)n+1 + Pi
hvor (NMP)n er en kjede med nukleotideri vanlig 3'-5'-fosfodiesterbinding, som kan få økt lengde ved å tilføre NDP, en ribo nukleosid difosfat, og Pi er uorganiske fosfat.
Severo Ochoa og Marianne Grunberg Manago oppdaget enzymet polynukleotid fosforylase i 1955 hos bakterier. Dette var det første eksemplet på at et enzym kunne lage nukleinsyrer.
Enzymet DNA polymerase som ble oppdaget av Arthur Kornberg bruker nukleotidtrifosfat i reaksjonen, til forskjell fra 5'-difosfat i polynukleotid forofylase. Polynukleotid fosforylase kan bare kan bruke ribonukleosid, ikke deoksyribonukleosider, slik at enzymet bare lager kjeder med RNA. Polyribnukleotid fosforylase er ikke avhengig av et templat slik som DNA polymerase. Man antar at polyribuonukleotid fosforylase kan bryte ned budbringer-RNA (mRNA) til nukleosiddifosfater.