Tynnsjiktkromatografering av klorofyll-løsning
- 1. Applisering.
- 2. Xanthofyll (gul)
- 3. Klorofyll b (gulgrønn)
- 4. Klorofyll a (blågrønn)
- 5. Beta-karoten
Klorofyll og karotenoider
Grønne planter og andre organismer som kan utføre fotosyntese inneholder grønne og gule pigmenter. Klorofyller og karotenoider er fettløselige og kan ekstraheres med organiske løsningsmidler f.eks. aceton, som frigjør pigmentene fra sine proteinkomplekser. Grønne blad gnis ut i en morter med aceton i et avtrekk. Etter filtrering og sentrifugering har man et grønnfarget klorofyllekstrakt med flere forskjellige pigmenter. Flere av pigmentene er ustabile etter at de er fjernet fra proteinkompleksene i thylakoidmembranene. F.eks. kan klorofyll miste magnesium (Mg2+) fra porfyrinkjernen og omdannes til feofytin. Mistes fytol-delen av molekylet omdannes klorofyll til feoforbid. Feofytin har en viktig funksjon som elektronakseptor i fotosystem II. Klorofyll a og b har porfyrinstruktur som består av 4 pyrrolringer, med Mg2+ som et chelat i sentrum av ringen, samt en 5-karbonring og 20-karbon fytolhale bundet til en av pyrrolringene. Forskjellen mellom klorofyll a og b ligger i ring 3. Klorofyll a har en metylgruppe og klorofyll b har en aldehydgruppe på denne ringen. Karotenoider er som oftest gule av farge og kan deles i to grupper: karotener og xanthofyller. Karotener er 40-karbonforbindelser og er rene hydrokarboner f.eks. - karoten. Xanthofyller inneholder oksygen eks. lutein, violaxanthin og zeaxanthin. b
Det er kjent 150 forskjellige karotenoider hos fotosyntetiserende organismer. Karotenoider finnes også i andre organismer f.eks. fugler (gule/røde fjær, gul eggeplomme), laksefisk (rødfarget astaxanthin), krepsdyr og andre invertebrater. Karotenoidene hos disse organismene tas opp via mat som har sin opprinnelse fra planteriket.
En av funksjonene til karotenoidene i plantene er å beskytte mot skadelige effekter av oksygen (singlett oksygen). Eksempler på karotener i planten er b-karoten (gul) med karakteristisk “trefingret” absorbsjonstopp og lykopen som gir rød farge på tomat.
Representative bølgelengder for de forskjellige fargene i lysspekteret (ROGGBIF) er gitt i parentes: rød (660 nm), oransje (610 nm), gul (570nm), grønn (520 nm), blå (470 nm), indigo (430 nm) og fiolett (410 nm).
|
Pigment |
Absorbsjonstopper ca. nm |
|
Klorofyll a |
410, 430, 663 |
|
Klorofyll b |
455, 640 |
|
Feofytin |
410, 665 |
|
-karotenb |
429, 452, 478 |
|
Xanthofyll (lutein m.fl.) |
422, 445, 474 |
Tynnsjiktkromatografering
Klorofyllekstraktet ansettes dråpevis som en tynn strek på en tynnsjiktfolie med kiselgel eller cellulose. Folien plasseres deretter i et kar med et upolart organisk løsemiddel i et avtrekk. Hvis man bruker en tynnsjiktfolie med cellulose vil vandringsmønsteret bli annerledes enn på en kiselgel ved at xanthofyllene vandrer lenger enn klorofyll. Ved kromatografering atskilles pigmentene siden de har forskjellig løselighet i en stasjonære fase og en bevegelig organisk fase. De mest lipofile pigmentene vil vandre nær væskefronten. Beta-karoten som er helt upolar vil gå helt i væskefronten. Ved tynnsjiktkromatografering anvender man seg av et sjikt av en spesiell sammensetning som gjør at visse pigmenter bremses særlig mye p.g.a. sin affinitet til adsorbsjonsmiddelet (Van der Waalske krefter). Xanthofyllene inneholder oksygen som gjør at de bindes sterkt til kiselgel. Ved denne separasjonsmetoden vil ikke rekkefølgen bare bestemmmes av pigmentenes løselighet i den bevegelige og stasjonære fasen, men også av adsorbsjonen til gelen.