Neonikotinoider ble ansett for å være relativt harmløse for mennesker, men ikke overraskende viser det seg at de allikevel kan gi skadelige effekter på virveldyr.
Neonikotinoider binder seg til og virker som agonist til acetylkolin på nikotin acetylkolinreseptoren kolbet til ligandstyrerte- Na+/K+ ionekanaler og i noen grad for /Ca2+ ionekanaler i synapsene som gir innfluks av Na+, K+ og Ca2+ nervesystemet Neonikotinoider pååvirker derved på kolinerg nervetransmisjon og blir aktivert av nevrotransmittoren acetylkolin. Insekter og pattedyr har forskjellig oppbygging av denne reseptoren. Derfor antok man i starten at neonikotinoider er mindre giftige for virveldyrene. Neonikotinoider har en annen virkningsmekanisme enn organofosfat- og karbamat-insketisider som er acetylkolinesterasehemmere. Neonikotinoider passerer ikke blod-hjernebarriæren. Neonikotinoider omsettes ved oksidasjon av cytokrom P450 oksidaser (CYP450) mengde avhengig av hvilket neonikotinoid og i hvilket dyr.
Imidacloprid, acetamiprid, thiakloprid og nitenpyram var av de første neonikotinoidene og inneholder en klorpyridinring som blir metabolsk omsatt til 6-kloronikotinsyre. Deretter fulgte dinotefuran og seine sulfoksaflor og sykloksaprid. Noen neonikotinoider har blitt forbudt å bruke i EU.