DNA og kromosomer

Celler kan dele seg og danne nye celler for vekst og reparasjon. Informasjonen om cellene er lagret i genomet med DNA i form av kromosomer i cellekjernen og DNA som sirkulært DNA i mitokondriene. Plantene innholder i tillegg sirkulært DNA i kloroplastene. i form av et kloroplastgenom. Den totale mengden DNA i cellekjernen eller organeller kalles genomet. Gener er deler av en DNA-sekvens som koder for RNA som deltar i syntese av enzymer og strukturproteiner i cellene. Genene er organisert på en rekke i kromosomene. Noen av genene er lenket sammen og nedarves samlet.  Kromosomer er fargeløse, men fikk navn etter at de kunne bli farget med spesielle fargestoffer. Kromosomene består av kromatin (DNA + protein). DNA er pakket og foldet i kromosomer. Pakkingen skjer ved hjelp av proteiner kalt histoner. Histonene er positivt ladet pga. høyt innhold av basiske aminosyrer, og danner nukleosomer som er perler på en DNA-snor, hvor DNA er negativt ladet pga. fosfatgruppene. Ca. 146 basepar med DNA ligger rundt en klynge med åtte (2x4) histonmolekyler som danner et nukleosom. Også arkebakteriene inneholder histoner. DNA er ca. 2 nanometer (nm) i diameter , og nukleosomene ca. 11 nm i diameter. Nukleosomene pakkes rundt en femte type histon H1 som festes til lenker med DNA og danner en 30 nm fiber. Denne fiberen er festet i løkker i et proteinskjelett.

DNA i B-form danner en høyrehånd heliks hvor sett fra begge ender vender med klokka. Z-DNA er venstrehånd heliks og danner en sikksakk ryggrad hvis det er alternerende puriner og pyrimidiner. Cellenes evne til å skru på eller av gener, genekspresjon, gjør at cellene kan differensieres. Det er både ytre og indre signaler som koordinerer uttrykket av gener, og på denne måten kan organismene tilpasse seg til omgivelsene og deres skiftninger.

Størrelsen på genomet varierer mellom organismene hvor størrelsen hos tarmbakterien Escherichia coli er 4.7·10⁶ basepar (bp), og hos bananfluen Drosophila melanogaster: 2·10⁸ bp, vårskrinneblom (Arabidopsis thaliana) 1.25·10⁸ bp og mennesket (Homo sapiens): 3·10⁹ bp per haploid celle. Gjær (Saccharomyces cerevisiae) inneholder ca. 6000 gener, bananfluen 14000 gener og eukaryotene kan generelt inneholde opptil 43000 gener fordi det finnes multigenfamilier. Hos prokaryotene består omtrent alt DNA av sekvenser som koder for protein eller RNA, mens eukaryotene inneholder store mengder ikk-kodende DNA bestående av flerkopisekvenser med repetert DNA samt ikke-kodende enkeltkopisekvenser kalt speiser-DNA. De ikke-kodene sekvensene kalles introner og de kodende kalles eksoner.  Prokaryotene har organisert genene i operoner, men kjernegenomet er uten operoner (unntatt noen eksempler fra rundormen Coenorhabditis elegans).

DNA-replikasjon - fra DNA til DNA

DNA replikasjon vil si at de to trådene i DNA tvinnes ut og hver av dem virker som oppskrift (templat) for en ny tråd, slik at det blir dannet to dobbelttrådete datterDNA. Replikasjonen starter ved en sekvens kalt ori. Bakterien E. coli med sirkulært kromosom har bare en ori, mens eukaryotene har mange.

Det dannes en replikasjonsgaffel ved utkveiling av trådene. Kunstig kan man få trådene fra hverandre ved å varme opp til 90 ^oC. I E.coli åpnes dobbeltheliksen med DnaA, DnaB, DnaC pluss et enkelttrådbindende protein. Hydrogenbindingene i DNA brytes og DNA heliksen må rotere for å fjerne stresset ved åpning av replikasjonsgaffelen. Topoisomeraser fjerner superløkker og superhelikser i dobbelttrådet DNA. 

Topoisomerase I bryter fosfodiesterbindingen i den ene trådene. DNA heliksen kan da rotere rundt tråden uten brudd. 

Topoisomerase II (gyrase) bindes til to dobbelttrådsteder og kutter begge DNA-trådene slik at et annet kromosom kan passere. Dette er viktig i DNA replikasjonen hos prokaryoter ved å fjerne stress i sirkulært DNA. Topoisomerase II virker ved fysisk stress i kjernen når to kromosomer presser mot hverandre. 

Cipro er et antibiotika som hemmer topoisomerase II hos prokaryoter og derved blokkerer DNA replikasjon. Etopsid og amsacrin hemmer også topoisomerase II, mens camptothecin hemmer topoisomerase I. Bakterielle topoisomeraser, kalt gyraser, hemmes av koumariner (novobiocin), kinoliner (naldixinsyre) og fluorokinoloner (ciprofloxacin).

ATP-avhengig DnaB (helikase) beveger seg langs DNA-tråden og bryter hydrogenbindinger. Det er en DnaB for hver tråd, en virker i 5´-3´-retning og den andre i 3´-5´-retning. DnaC sørger for at DnaB blir avlevert og satt på rett plass. Når DnaB har åpnet trådene festes enkelttrådbindende protein som retter ut DNA. Nytt DNA lages av enzymet DNA polymerase III som lager fosfodiesterbinding mellom 3´ OH på et sukkermolekyl og 5´-fosfat på det andre sukkermolekylet. DNA polymerase III kan bare feste nukleotider på en fri 3´ OH og lager derfor DNA i 5´ til 3´retning. Templatet avleses i 3´til 5´-retning. De to DNA heliksene er antiparallelle, og en har fri 3´-OH ende og en har fri 5´-fosfat ende. Ledetråden blir derfor laget kontinuerlig og lagtråden lages diskontinuerlig. Lagtråden lages som korte 5´-3´-segmenter kalt Okasaki-fragmenter , oppkalt etter Reijji Okasaki 1968, som kobles sammen med DNA polymerase og ligase. DNA polymerase III trenger en primase som lager korte stykker med RNA komplementært til DNA templat. Flere RNA primere lages langs lagtråden. DNA polymerase III korrekturleser replikasjonen og inneholder en 3´-5´-eksonuklease . RNA primere fjernes deretter, og eukaryotene har ribonuklease H som fjerner RNA primere. Prokaryoter har DNA polymerase I med 5´-3´eksonuklease.

Helikaser er enzymer som tvinner opp dobbelttråden i DNA (DNA-helikaser) eller RNA (RNA-helikaser). DNA-helikaser deltar i DNA-replikasjon hvor de to atskiller dobbelttråden i en replikasjonsgaffel slik at hver av dem kan kopieres.  ATP gir energi som trengs for å bryte hydrogenbindingene mellom nukleotidbaseparene RNA-helikaser deltar i å bestemme formen på RNA.

Transkripsjon - fra DNA til RNA

Det er tre hovedtyper RNA polymerase hos eukaryotene:

RNA polymerase I i cellekjernen lager ribosomalt RNA (rRNA).

RNA polymerase II i plasma i cellekjernen (nukleoplasma) deltar i syntese av pre-prebudbringer RNA (pre-mRNA).

RNA polymerase III i nukleoplasma lager transport RNA (tRNA) og 5S rRNA.

Før transkripsjonen kan starte trengs generelle transkripsjonsfaktorer (GTP) som angir korrekt startsete for transkripsjonen i et transkripsjonsinitsieringskompleks.

   For å kunne starte transkripsjonen trenger prokaryot RNA polymerase polypeptider kalt sigmafaktorer, mens eukaryot RNA polymerase II inneholder 7 generelle transkripsjonsfaktorer (TFII). TFIID bindes til TATA-boksen via et TATA-bindende protein, TFIIB bindes, samt TFIIE, TFIIF og TFIIH som er protein kinaser som fosforylerer RNA polymerase. Noen av GTP fjernes og transkripsjonen starter. RNA polymerase II atskilles fra transkripsjonsinitsieringskomplekset og fortsetter langs antisens-tråden i 3´-5´-retning.  Promotere er DNA-sekvenser oppstrøms for initieringsstart, og hos eukaryotene må disse minimum bestå av TATA-boks, CAAT-boks og GC-boks.  Hver av de tre RNA polymerasene har forskjellige promotere. RNA polymerase II har 100 basepar oppstrøms for initiseringsstart en proksimal promotersekvens, og 25-35 basepar oppstrøms ligger TATA-boksen med nukleotidsekvensen TATA AA(A) som angir start for sammensetning av transkripsjonsinitiseringskomplekset. CATT-boks og GC-boks binder transkripsjonsfaktorer som regulerer hastigheten på transkripsjonen, og disse distale reguleringssekvensene som ligger i området 1000 basepar fra transkripsjonsstart kalles cis-virkende sekvenser siden de ligger inntil transkripsjonsenheten de regulerer. Transkripsjonsfaktorer som bindes til de cis-virkende sekvenser kalles trans-virkende faktorer. Transkripsjonsfaktorene kalles, som hos prokaryotene, for aktivatorer eller repressorer avhengig av om de aktiverer eller undertrykker transkripsjonen. Det kan finnes mange cis-virkende faktorer som gir  positiv eller negativ styringskontroll i promoteren. I tillegg til regulering innen promoter er det mulighet for regulering via kontrollelementer som ligger tusenvis av basepar vekk fra transkripsjonsstart. Økere  ("enhancere") er slike positive kontrollelementer oppstrøms eller nedstrøms for promoter som øker transkripsjonen f.eks. i syntese av flavonoider i planter.  Responselementer er cis-sekvenser som deltar i genregulering via hormoner eller andre ytre signaler. 

Transkripsjonsfaktorene som bindes til DNA er tredimensjonalt organisert og foldet slik at det kommer i direkte fysisk kontakt med initiseringskomplekset. Transkripsjonsfaktorene inneholder to DNA-bindende domener, et strukturelt evolusjonsmessig konservert  transkripsjonsaktiverende domene og et ligandbindende domene. Det er det DNA-bindendene domene som fester seg til DNA-heliksen med ionebindinger , hydrogenbindinger eller hydrofob interaksjon.

Transkripsjonsfaktorer

   Transkripsjonsfaktorene deles inn i hovedgrupper avhengig av struktur og hvilket DNA-bindende domene de inneholder:

Zink finger inneholder grunnstoffet zink og bindes som monomer eller dimer til DNA.

Leucinzipper som er et kort alfaheliks polypeptidkjede med aminosyren leucin, og som fester seg til DNA langs den hydrofobe overflaten til leucin. Basisk zipper er en varietet av leucinsipper hvor andre basiske aminosyrer kan delvis erstatte leucin. Basiske zippere er vanlige transkripsjonsfaktorer i planter.   Heliks-vending-heliks består av to alfahelikser atskilt av en vending i polypeptidkjeden. Heliks-løkke-heliks transkripsjonsfaktor består av en kort alfaheliks koblet i en løkke til en lenger alfaheliks.  En type heliks-vending-heliks transkripsjonsfaktorer som ble først funnet i bananflue blir kodet av såkalte homeotiske gener. Homeotiske gener lager transkripsjonsfaktorer bestemmer hvilken struktur som lages på bestemte deler av kroppen.  Flere gener deltar i et genprogram for en struktur og skrur derved  på og styrer utviklingsprosesser som bestemmer formen og utseende til en organisme (fenotypen). Skjer det en mutasjon i et homeotisk gen kan dette gi homeose, feil kroppsorgan dannet på feil sted. Det klassiske eksemplet er en mutasjon som gir genet antennapedia i bananflue (Drosophila) som gjør at et bein dannes i stedet for en antenne. Alle de homeotiske genene i bananflue innholder en evolusjonsmessig konservert homeoboks med ca. 60 aminosyrer. Slike homologe homeobokssekvenser finnes i alle dyr og planter og viser det evolusjonsmessige slektskapet hos alle høyerestående organismer på jorda. MADS-boks gener i planter koder for heliks-vending-heliks transkripsjonsfaktorer som inneholder et MADS-domene, og avgjør f.eks. plassering og utviklingsskjebne til alle bladene som utgjør en blomst.

    Bakteriene (prokaryoter) og gjær (eukaryoter) må raskt kunne respondere og tilpasse metabolismen til endring i tilgjengelighet og sammensetning av næringsstoffer i omgivelsene på utsiden av organismen. Mest studert er laktose-operonet (lac) i tarmbakterien E.coli som er styrt av negativ kontroll via en repressor. Hvis E.coli  får melkesukker (laktose)  i næringsmediet lager RNA polymerase en polycistronisk mRNA som inneholder 3 gener på rekke som gjør at bakterien lager enzymene β-galaktosidase, permease og actylase. Disse proteinene gjør at bakterien rakst kan ta opp og omsette laktose. Et annet eksempel er tryptofan-operonet (try) i E. coli som starter biosyntesen av flere enzymer som deltar i syntesen av aminosyren tryptofan.